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一、實驗目的
通過檢測處于凋亡狀態(tài)的細胞數(shù)量來檢驗目的基因與細胞凋亡的關(guān)聯(lián)或者藥物對細胞凋亡的影響。

二、實驗原理
在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸 (phosphotidylserine，PS) 位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡細胞中，PS 從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。

Annexin-Ⅴ能與 PS 高親和力結(jié)合?？赏ㄟ^細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。用標記了 FITC 的 AnnexinⅤ作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。細胞壞死的過程中也會發(fā)生細胞膜損傷，壞死的細胞會結(jié)合 Annexin V-FITC。

Annexin V-FITC 通常與細胞膜非滲透性核酸熒光染料聯(lián)合使用以檢測凋亡細胞。常用的染料是 PI。正常細胞和早期凋亡細胞的細胞膜是完整的，核酸染料 Propidium iodide(PI) 不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI 能夠透過細胞膜與細胞核結(jié)合呈現(xiàn)紅色。

將 AnnexinⅤ與 PI 匹配使用，可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。壞死細胞可以同時與 Annexin V-FITC 和 PI 結(jié)合顯色，而 PI 則被排除在活細胞 (FITC 陰性) 和早期凋亡細胞 (FITC 陽性) 之外。在沒有巨噬細胞的情況下，凋亡的最后階段會像細胞壞死一樣發(fā)生整個細胞的解體，從而使凋
亡晚期的細胞也同時被 FITC 和 PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性。

三、實驗步驟
1. 待各實驗組 6 孔板細胞生長至覆蓋率約為 70% 時，收集上清，胰酶消化貼壁細胞，完quan培養(yǎng)基重懸成細胞懸液，與上清細胞收集于同一 5 mL 離心管中，每組設(shè)三個復孔 (為保證上機細胞數(shù)足夠，細胞數(shù)目 ≥ 5×105/處理）。若為懸浮細胞，直接收集。
2.1000 g 離心 5 分鐘，棄上清，用 PBS 輕輕重懸細胞；
3.1000 g 離心 5 分鐘，棄上清，加入 195μl Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細胞。
4. 加入 5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
5. 加入 10μl 碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
6. 使用鋁箔進行避光，室溫 (20-25℃) 避光孵育 10-20 分鐘，孵育過程中重懸細胞 2-3 次，隨后置于冰浴中。
7. 立即上機檢測

四、常見問題及解答
Q1：構(gòu)建了慢病毒轉(zhuǎn)染的穩(wěn)轉(zhuǎn)株（帶綠色熒光），檢測凋亡使用 FITC 也是綠色熒光，是否會干擾？
A：會有干擾，可以換紅色熒光標簽的試劑進行檢測。

Q2：鏡下觀察有很多漂浮細胞，可以看到凋亡，為什么染色后跑流式，凋亡比例跟 control 差不多？
A：將漂浮的細胞收集起來再進行實驗

Q3：Annexin V-FITC 和 PI 在激光共聚焦顯微鏡下分別選擇的測量波長是多少？
A：綠色熒光可以使用 488nm 激發(fā)，PI 是紅色熒光，使用 535nm 激發(fā)

Q4：FITC 和 PI 孵育時間過短，對結(jié)果有什么影響？
A：孵育時間過短，影響裝載效果，時間過長，也要考慮細胞本身的狀態(tài)。

Q5：想問一下用流氏檢測應該怎么設(shè)門？
A：用陰性未染色的細胞調(diào)電壓，門設(shè)置，annexin V-FITC 單染、PI 單染來調(diào)補償。